Nature综述：人类微生物培养及培养组学culturomics

Nature Reviews:人类微生物培养以及培养组学

Culturing the human microbiota and culturomics

Jean- Christophe Lagier1, Grégory Dubourg1, Matthieu Million1, Frédéric Cadoret2,
Melhem Bilen1,3, Florence Fenollar4, Anthony Levasseur1, Jean- Marc Rolain1,
Pierre-Edouard Fournier 4 and Didier Raoult1*

1、2、3、4. 法国，马塞，艾克斯－马赛大学(1409年成立艾克斯大学，后发展成为普罗旺斯、地中海和保罗-塞尚三所大学，于2007合并成为法国最大的大学)

热心肠日报导读

Nature Reviews：一文读懂用于人体菌群研究的培养组学（综述）

mildbreeze 07-01 热心肠日报

原标题：人类菌群培养与培养组学

① 培养组学使用多种培养条件促进难培养的菌生长，结合MALDI-TOF质谱和16S rRNA测序等技术，以鉴定细菌等微生物；
② 人体肠道中存在约80%的未知细菌，近年来培养组学的应用不仅使可培养的人体细菌增加了上百种，还用于临床的致病菌分离鉴定，发现新的分类单元，减少了宏基因组分析中的未分配OTU；③ 用培养组学获得的菌株可用于体外和动物实验，对于肠道菌群相关疾病的研究必不可少；④ 培养组学还能用于分离潜在的益生菌，是研发细菌疗法的基础。

主编评语：近年来培养组学的快速发展，使得可培养的人体细菌增加了几百种，拓展了人们对宿主-细菌关系的认知。Nature Reviews Microbiology近期发表综述，重点讨论了培养组学在人体菌群研究中的应用，值得专业人士关注。

摘要

肠道菌群对于维持人类健康和疾病发生中起重要的作用。近年来组学技术的出现及其广泛应用，快速提高了我们对肠道菌群生态系统的认识。特别是，宏基因组学技术的使用揭示了肠道菌群的多样性，但也突出表明，肠道中的大多数细菌仍未被培养。作为微生物学中培养技术的一部分，培养组学是在培养和鉴定居住在人体肠道中的未知细菌的过程中发展起来的。由多种培养条件和快速鉴定细菌组成的培养组学方法使得数百种与人类相关的新微生物得以培养，为研究宿主-细菌关系提供了令人兴奋的新视角。在这篇综述中，我们将讨论为什么以及如何发展培养组学。我们描述了培养组学如何扩展了我们对细菌多样性的理解，然后探讨了培养组学如何应用于人类微生物研究以及对人类健康的潜在影响。

前言

肠道菌群在人类健康中的重要性目前正成为人们关注的焦点。肠道菌群的组成与代谢紊乱和炎症性肠病联系在一起已有十多年了；然而，肿瘤学领域的最新进展和肠道脑轴的发现拓宽了我们对与肠道菌群变化相关疾病谱的理解。令人惊讶的是，尽管Metchnikoff首次描述了益生菌的有益影响，但人们对与人类有互惠关系的共生微生物的兴趣以及它们在保护我们不受外部病原体侵染或代谢途径中的作用被长期忽视。从宏基因组学开始，组学技术的发展突出了肠道细菌在几种疾病中的作用。然而，这些基因组技术提供了有限的视角，因为它们很难检测到低丰度的群体。有趣的是，他们揭示了~80%居住在人类肠道的细菌是未知的，因此在那个时候被认为不可是培养的。与此同时，环境微生物学家开发了新的方法来培养不能用常规技术培养的细菌，从而在微生物学中开创了培养组学。这一进展推动了培养组学的发展，以便发现肠道中的未知细菌。利用多种培养条件和长时间的孵化，在不到5年的时间内从肠道中分离出数百种新细菌。除了增加对细菌种类的了解外，培养组学还可以提供可用于体外实验的细菌菌株，并通过模式动物确认特定细菌在疾病发病机制中的作用。此外，一些用培养基鉴定有益健康的细菌，可作为益生菌，和/或未来细菌疗法的候选菌。在这篇综述中，我们首先讨论为什么要发展培养组学和如何发展培养组学。我们描述了培养组学如何扩展了我们对细菌多样性的理解，并探讨了如何将培养组学应用于研究人类与微生物的关系及其对人类健康的潜在益处。

微生物组和宏基因组学

宏基因组学首先被用来全面描述复杂的环境微生物生态系统的组成，例如海水中微生物种群特征的开创性工作。在精细性研究描述了粪便样本或健康人结肠活检中肠道微生物的多样性之后，对人体肠道内细菌多样性的进一步研究促进了解肠道菌群与肥胖、糖尿病、炎症性肠道疾病和结直肠癌之间的关系。宏基因组学已被广泛应用于鉴定与生理状态或疾病相关的微生物。然而，由于测序读长较短，物种间的鉴别难度较大，这使得它们的精确分类变得困难。这一挑战潜在地解释了为什么在细菌物种和人类肠道之间观察到的最强有力的关联是在人类特有的属水平。然而，最近在测序方面的发展已使鉴定超越了物种水平(即菌株水平)，但仅限于占主导地位的种群。生物信息学方面的重大进展还使我们能够使用相似算法或聚类工具分析整个序列数据集，而无需进行物种分类。然而，还需要进一步的发展，例如，优化在线工具，以缩短分析测序数据所需的时间，并减少不同实验室之间在分类分配方面的异质性。除了分类鉴定之外，微生物DNA的鸟枪法测序还可以对基因进行功能注释，从而得知群落的功能潜力。然而，尽管取得了这些进展，但由于实验室之间的实验方法不同，特别是在DNA提取或生物信息学分析方法的选择导致标准化的限制。此外，高通量测序方法由于难以在极低水平上检测微生物而特别容易受到深度偏差的影响(图1)。在有足够的测序深度(也称为测序覆盖度)时，已经制定了几种测序策略来加强对少数群体的检测，但很难评估这些方法的有效性，因为同时进行培养组学和高通量测序分析的实验都很少进行。不过，有两项研究显示，培养与未培养样品之间有很大的重叠。尽管测序深度有所提高，但考虑到粪便样本中每克粪便含有上亿个细菌，而且培养物能够检测到每克粪便有10¹⁰-10¹¹个细菌，16S核糖体RNA(rRNA)基因测序应该产生至少10⁸-10⁹个读长以达到对培养的可比得上的敏感性，而这种敏感性尚未达到。除了测序深度偏差，对应于微生物暗物质的许多序列仍然末被注释。与培养技术不同，宏基因组学不能确定细菌是死的还是活的；宏基因组学序列仅占DNA总库的一部分。此外，利用DNA测序来确定微生物的活性和生理状态也是一项具有挑战性的工作。然而，生物信息学的重大进步促进了一种算法的发展，该算法利用单个时间点的宏基因组测序数据生成复制索引。与测序相关的缺陷可以通过整合宏转录组和宏基因组来评估细菌群体中基因表达模式的编码潜力。同样的，宏代谢组学和宏蛋白组学、培养组学可以与宏基因组学数据相结合，从而深入了解肠道细菌群落的功能。

培养组学

培养组学是利用多种培养条件来进行培养细菌的方法。MALDI-TOF质谱以及16sRNA测序用来鉴定细菌物种。在描述培养组学前，我们将会简单的介绍环境以及临床微生物学家在培养组学的贡献，包括如MALDI-TOF质谱鉴定菌落的方法的出现，促使了微生物培养组学的发展。

环境微生物的培养组学重生

第一批重启培组学养的研究是由环境微生物学家进行的。例如，2007年的一项研究通过在扩散室(diffusion chamber)中孵化环境样本模拟了细菌的自然环境，以增加分离培养细菌的数量和多样性。在最近发表的一篇综述中，已知的14,300种原核生物中只有2,172种原核生物 (~15%) 至少从人类身上分离出一次，另外12,128种 (~85%)  是从环境中分离出来的。平板计数差异法(great plate count anomaly)是Staley和Konopka在1985年发明的一个词汇，用来描述显微镜中观察到的自然环境中细胞数量与在琼脂培养基上形成的活菌数量之间的差异，后者明显较低。环境微生物学家已经在很大程度上研究了这一差异的机理，以增加环境样本中可以培养的微生物的比例。为了检测少数群体，环境微生物学家首先使用稀释培养法，随后该方法才用于研究人类肠道微生物学。稀释培养法是连续的稀释细菌群体直到无细菌生长为止。同时，环境微生物学家发展了培养方法和培养基以模仿微生物的自然环境。例如，通过混合使用来自海水的组份成功地培养了遍在远洋杆菌 (Candidatus Pelagibacter ubique，以前称为SAR11)。该物种长期被认为是不可培养的，尽管观察到的源自该物种基因组的reads数目超过了来自海洋表面基因组reads总数的四分之一。对这种细菌的第一次培养，以及α-蛋白细菌SAR11系列中其他成员的第一次培养，已经成为进一步研究的必要基础，这些研究提高了我们对海洋细菌之间关系的理解。扩散室中的两层膜允许环境养分进入，但限制细菌细胞，使得可以在实验室成功模拟自然环境。扩散室的使用使得培养菌落的数量增加到了300倍。此外，共培养还允许从不同环境中培养细菌，因为共培养可以提供其他原核生物分泌的促生长因子。最后，通过对细菌间通讯途径的阐明，可以识别标准培养基中缺乏的营养物质和信号分子，这些物质是细菌生长所必需的，然后可以添加到培养基中。

图1a：宏基因组学研究的优点

图1b：宏基因组学研究的缺点

高通量测序方法使得能够在前所未有的短时间内对大群体进行比较，因为在过去的十年中，由于整合工作流程，产生结果所花费的时间大大减少。 测序可以识别未培养的细菌，并通过测量每个分类群的相对丰度将微生物特征与特定的生理状态或疾病联系起来。此外，细菌种类可以分组，没有分类分配。鸟枪法测序通过对基因组和编码潜力的分析，可以推断微生物群落的功能。然而，这些方法受所用实验方案的异质性限制。用于提取DNA的方法或用于扩增的引物不同，可以获得不一致的结果。目前提出的各种生物信息学分析方法(例如，可操作分类单元OTUs聚类，分类学分配或统计分析)可以显著影响结果。尽管最近取得了进展，测序方法不能区分活细菌和游离DNA，但他们无法轻易发现少数群体(例如，每克粪便中 < 10²个细胞存在的细菌)。

临床微生物学家对挑剔细菌的培养

有些微生物需要特定的培养条件才能生长。其中，挑剔的微生物只有在特定的营养物质存在的情况下才会生长。同样，专性厌氧菌(obligate anaerobes)也不能在氧气存在的情况下生长。临床微生物的实验室培养的复兴是由专门培养胞内细菌的微生物学家发起的。在很长一段时间内，这些细菌只能通过动物接种或胚胎卵子培养。首先证明了利用系统培养与人类疾病相关的胞内细菌主要立克次氏体种，主要包括分别引起立克次体病的长立克次体和引起惠普氏疾病的致病因子-黑刺草，Tropheryma Whpplei。壳-瓶技术(shell- vial technique)，主要包括临床样本离心的一个基本步骤，是专门从事培养细胞内细菌实验室使用的一种技术。后来，基因组测序的方法可以识别通过纯培养分离菌的代谢缺陷，从而设计无菌培养基。在基因组测序的指导下，设计了新的无菌培养基配方，对Q热病的致病菌贝纳特氏立克次体、鞭毛虫和特定的衣原体(肺炎病原体和性传播感染的病原体)进行了研究，为细胞内微生物的综合研究提供了便利。在固体培养基上容易培养这些细胞内细菌，提高了我们对其致病性、抗生素敏感性的认识，并进一步设计了实验模型和新的诊断工具。

厌氧菌(Anaerobes)是健康的人体微生物的主要成员，尤其是在人体肠道微生物中，但只有少数引起人类感染。培养专性厌氧菌是微生物实验室面临的一项挑战。事实上，培养专性厌氧菌需要特定的细菌学设备来提供无氧环境，以及专门的试剂，包括含有多种补充剂的复杂培养基；厌氧培养介质必须含有碳源、大量元素、金属和一些生长因子。1890年首次使用动物组织(脑、肉或心脏组织)作为培养基的补充物，构成第一批非选择性培养基。在此基础上，将卵基培养技术用来培养梭菌和镰刀菌。巯基乙酸盐是一种用途广泛的液体培养基，是临床微生物学中应用最广泛的培养基之一。选择性培养条件包括使用抗生素、胆汁和染料(如结晶紫)或物理过程(如热休克)。

为了在缺氧气条件下培养一些细菌，已经先后设计了一系列系统，如厌氧罐、加斯帕系统和厌氧室。亨盖特首先彻底改变了对氧气及其敏感的微生物的培养，包括硫酸盐还原菌和产甲烷的古菌。他的方法是使用滚筒将大气中的氧气替换为其他气体，如N2、CO2或H2。然而，这项技术耗费时间，需要高水平的培训，且在专业的实验室中使用。

早在1970年代就进行了第一批探索肠道微生物的培养研究，并研究了饮食如何影响肠道微生物的组成。有趣的是，这些早期的研究发现，一些细菌与癌症有关，如之后的例子所表示的那样。总的来说，19世纪70年代，肠杆菌科和韦荣球菌科是来自人类肠道微生物的400种不同微生物物种中最常见的一种。当时，正常的微生物群被认为是由非孢子形成的、厌氧、棒状的细菌所主导。有趣的是，1995年鉴定的许多优势种与后来被宏基因组发现的同一优势种相对应。

最近，尽管这些厌氧菌通常在严格的厌氧条件下生长，但在好氧环境中成功地培养出了猪链球菌 、普氏菌、坏死梭杆菌、芬戈尔德菌、莫拉菌属和阴道放线菌。研究人员使用琼脂添加高剂量的谷胱甘肽和抗坏血酸。虽然其作用机制尚不清楚，但与以往研究相比，高浓度的抗氧化剂被认为具有一定的作用。在一项在培养基中加入尿酸的大型研究中，276种细菌，包括82种严格的厌氧菌，成功地被有氧培养。2016年的一项研究分离出不同的产甲烷古菌，这些菌株对(多形拟杆菌)的存在对氧极为敏感，在双腔瓶中用作氢源。这些例子说明了临床微生物学家在培养与人体相关的原核生物方面的巨大贡献。

基质辅助激光解析电解离质谱(MALDI- TOF mass spectrometry)进行微生物的鉴定

基因测序是细菌鉴定和分类的关键。因此，16S rRNA基因的扩增和测序被认为是一种通用的细菌种鉴定方法。然而，尽管这种分子技术有诸多优点，但是昂贵和耗时的，这限制了它在高通量培养组学中的应用。因此，需要一种经济有效、快速的细菌鉴定方法。1959年，有人提出可以根据微生物的化学成分来鉴别微生物的概念。1975年，革兰氏阴性细菌所拥有的特定生物标志物被鉴定，30年来人们一直认为，使用一种算法将蛋白质质谱的结果与参考数据库进行匹配，将使我们能够准确地识别细菌。然而，技术和时间限制阻碍了鉴定微生物的质谱技术的发展及其在临床微生物学中的应用。2009年，在常规临床微生物学实验室中使用MALDI-TOF质谱在属和种两级进行精确鉴定微生物的研究首次被报道。MALDI-TOF质谱法既节省时间，又经济有效，结果的重现性和所需的用户培训水平较低，使得MALDI-TOF质谱法成为临床微生物鉴定的参考方法。脱离了快速鉴定工具，培养组学的研究方法就不可能存在，这一突破使得设计培养组学的方法探索复杂的生态系统成为可能，例如人类肠道微生物。

培养组学和人类微生物

培养组学是一种使用MALDI-TOF质谱法鉴定细菌种类的高通量培养细菌的方法。在其发展过程中，首要目的是使该方法能够提供多种培养条件，确定人类肠道挑剔细菌的生长条件。利用血液培养瓶中的血液和瘤胃液改进培养基，促进少数群落生长，取得了较好的效果。在第一次培养组学研究中，212种培养条件产生了30,000多个菌落，随后进行了MALDI-TOF分析。事实上，共有341种细菌被培养，其中包括31种新的细菌物种属于稀有门，如Synergistetes或异常球菌-栖热菌。有趣的是，这341种细菌中有一半以上是首次从人类肠道中发现的。通过对本研究结果的分析，确定了70个有用的培养条件，其中18个条件被认为是从粪便样品中鉴定细菌的最佳条件。这些最佳培养条件的确定使更多的样本能够在以后的研究中进行测试。通过文献查阅，我们对人类肠道细菌种类的了解进一步增加，以找出第一批培养组学的弱点，鉴定以前在其他研究中发现但尚未通过培养组学鉴定的细菌。事实上，研究的重点是蛋白质细菌、微嗜氧菌和嗜盐细菌的培养条件，因为这些物种不容易使用培养方法进行鉴定。使用新鲜粪便或从不同程度的肠道采集的样品也能培养出大量对氧敏感的细菌。此外，利用放大镜实现了微生物菌落的检测。总的来说，最能确定的培养条件是在厌氧条件下用瘤胃液和羊血预孵育样本。在进行这些培养研究的同时，还开发了一些策略来鉴定细菌种类，并增加我们对人体肠道细菌库的了解。首先，为了分离单个细胞来检测少数群体，采用了“连续稀释”技术。该技术可应用于高通量培养的96孔板上。根据这一原理，第一次分离出两种被认为具有临床意义的细菌(普鲁士尼茨菌和嗜粘液阿克曼氏菌)。有趣的是，对这些物种的某些特殊生长要求已经被确定，包括添加粘蛋白作为嗜粘液阿克曼氏菌和醋酸作为普鲁士尼茨菌的补充。最近，高通量测序方法和培养依赖的技术相结合，开发了一种利用微流控技术分离和鉴定新细菌的新技术。用这种方法鉴定了一个新的属，隶属于反刍动物科。肠道中重要而丰富的产生丁酸的细菌，如粪杆菌和罗氏菌属，也已被利用培养组学鉴定。通过对人粪便中木聚糖分解微生物群落的鉴定，可以检测出新的细菌种类，如肠类杆菌、多瑞杆菌和迷迭香菌。

最近，靶向表型培养被用于鉴定孢子化细菌，首先用乙醇对粪便样品进行预孵育，以增加孢子的数量。这种预孵育可培养137种细菌，其中包括69种新的细菌分类群。作者发现，在健康个体肠道菌群中，55%的细菌属能够产生弹性孢子。此外，他们认为这些细菌可以适应宿主与宿主之间的传播.这种方法是一种有趣的方法，因为与培养组学相比，该方法只接种了一种培养基。

总的来说，这些最近的研究使人类肠道中分离出的细菌种类增加了一倍多，我们能够研究这些分离物的表型和功能。此外，所有这些细菌的全基因组测序将有助于理解未来的宏基因组研究。

培养组学的主要缺点仍然是工作量大和无法测试与其他方法一样多的样本，如宏基因组学。此外，尽管从一开始就取得了进展，但培养组学无法识别所谓的“尚不能培养”的微生物。最后，培养组学不能直接提供基因表达的数据以及细菌功能而基因组测序技术可以用来评估新分离微生物的功能潜力。

图2 培养组学的工作流程

培养组学最初是为了鉴定肠道菌群中的新细菌而设计的，但后来被应用于其他微生物群落，如人类阴道和尿道微生物群落。培养组学的第一步是将样本分成不同的培养条件，并使样本多样化(A图)。培养条件旨在抑制多数种群的生长，并促进较低浓度的挑剔微生物的生长(B图)。然而，有针对性的培养条件被用来恢复特定的分类群。培养组学的一个重要特征是MALDI-TOF质谱法快速鉴定(用时 < 1小时)，它依赖于分离物的蛋白质质谱结果与可更新的数据库的比较(C图)。如果鉴定失败，则对分离物进行16S核糖体RNA(rRNA)测序(D图)。如果与最近的官方菌株有相似性 < 98.65%，该分离物可能是一个新物种。新分类群的发现得到了基因组测序的证实(E图)。物种分类组学被用来对细菌进行正式描述。所有鉴定结果都与从人类中回收的细菌种类数据库进行比较。通过培养鉴定新物种，增加了与人类有关的细菌种类的储备。

培养组学的结局

增加已知细菌的数目

在第一个培养项目启动之前，已知了13,410种细菌和古菌，其中只有2172种来自人类的物种被培养出。将培养组学应用于各种项目，特别是人类微生物群落，已经鉴定出以前在人类中发现的细菌，还有一些没有发现的细菌。

与其他生态系统相比，肠道菌群落中只有688种细菌和2种古菌先前在人类肠道中鉴定到，而在针对各种粪便样品的培养组学建立后，培养了1057个原核生物，从而扩大了细菌的种类。自那时以来，从人类肠道中分离出73种，从泌尿道分离出13种新种，从阴道中分离出15种，从呼吸道中分离9种，从人体皮肤分离2种，从人初乳中分离1种，从患有骨髓炎的个体脚分离1种。总体而言，与人类相关的物种数量显著增加，使总数达到2，671种。事实上，培养组学使得目前的细菌种类中有23%可以从人体样本中分离培养至少一次。

从共生到病原菌

除了非常罕见的例外(例如霍乱、鼠疫和肺结核的病原体)，人类的细菌病原体都是共生的，因为它们能够在不引起任何感染的情况下对人体部位进行定殖。这一发现使微生物学家重新考虑了他们对共生体和病原体的性质的看法。例如，目前认为有益于健康的细菌，其中包括嗜粘菌和短链菌，最初是作为共生菌分离出来的，但最近从临床标本中发现是病原体。值得注意的是，嗜粘菌是在一次菌血症事件中使用培养组学发现的。需要进一步的证据来确定这些细菌的潜在致病性。未来，在培养和诊断微生物学实验室之间共享MALDI-TOF数据库将有助于从临床标本中识别潜在的病原体。在这方面，后来从57个具有不同临床特征的临床标本中分离出了12种以前在肠道微生物培养研究中培养的新物种。在这12种新物种中，11种是厌氧菌，反映出从人体肠道分离出来的新物种中很大一部分是不耐氧的。其中一些物种也是从临床标本中找到的，但据认为是由于它们的定植而不是导致疾病而被鉴定到的。例如，沙氏梭菌和马佐尼梭菌(原为梭状芽孢杆菌)从粪便中培养，接种于艰难梭菌特异性培养基上。这突出表明有必要提供这些新分类群的质谱，以便任何临床微生物学实验室能够对它们进行鉴定，以确定这些细菌的存在是短暂的还是具有临床意义的。从特定临床环境如脓肿反复分离菌种，如猪放线菌(Actinomycesihumi)或嗜海王星(Peptoniophus)，表明它们具有重要的致病作用。类似的，铁蒙拟杆菌(anaerobic
Bacteroides timonensis)是从血液中分离的，血液是无菌位点，因此，它不太可能是一种污染物。这些例子导致人们认为，临床微生物实验室很可能会识别已知存在的微生物，而不是发现未知的微生物。总的来说，培养组学导致了在MALDI-TOF质谱数据库中包含新分类群，从而增加了临床标本中鉴别到的病原体的数量。

报告新的分类群

培养组学不仅导致已知的人类相关细菌数量的增加，还导致了用于描述未知细菌的方法的改变。在第一阶段报告一个新的细菌种类，分类组学的概念被引进用来描述新分离的细菌，以一种一致的方式整合不同的数据类型例如MALDI-TOF质谱和基因组测序数据，新的物种的发布格式也已经被创建，其中仅包括GenBank 16S rRNA登录号和一组菌株数，以便于快速传播培养组学发现的新物种。

从操作分类单元到细菌种类

由宏基因组研究产生的操作分类单元(OTUs)由来自未鉴定的生物的DNA序列组成，用于对密切相关的微生物群进行分类。培养组学的作用可以通过降低未分类的OTU的数量，以及增加培养的细菌的数量来衡量。16S rRNA基因的超变区测序是物种分类学的金标准，在16S rRNA基因的分析中，所有的序列都通过质量过滤器进行聚类。根据定义，OTU包含的所有聚类序列的百分比序列相似性阈值内(通常为97%)。虽然OTU聚类的主要优点之一是分析的时间短，但这些OTUs的生物解释仍然是一个挑战。每个OTU都是每个集群的代表，它们构成了一个巨大的信息来源，表明了我们目前无法获得所有微生物遗传多样性的能力。将OTUs整合到宏基因组学中，为破译微生物群中的遗传多样性铺平了道路。许多生物信息工具已经被开发出来，用于对宏基因组样品中的物种和OTUs进行分类。这些工具大大简化了OTUs对宏基因组样品的归属。因此，OTU分配所提供的大量数据要求对每个OTU进行严格分类，并使用标准化分析对元组样本进行系统比较。最近的一项研究通过将宏基因组学与培养组学相结合，使未知物种得以分类。事实上，初步研究发现，只有15%的物种是使用这两种方法发现的。例如，一项研究表明，在已查明的247种新物种中，50%以上属于特定的OTUs。值得注意的是，从粪便样本中对84种来自粪便的宏基因组样本的分析显示了许多潜在的新物种，如大量的OTUs所反映的那样。未经探索的微生物世界-被称为微生物暗物质-将通过多学科方法逐步被揭示出来。

图3 培养组学在临床微生物学中的历史及应用前景

发现稀有和少数群体的新培养方法促进了与人类相关的细菌库的增加。这些新细菌的基因组测序作为分类基因组学的一部分，使得用于高通量宏基因组研究物种分类的序列数据库得以更新，通过精确识别本来将被分配给操作分类单元的细菌，使微生物的暗物质(即宏基因组研究中未指定的序列)能够得到阐明。测序还可帮助确定分类群存在与否与健康或疾病状态之间的关系。同时，更新用于临床微生物实验室中病原体鉴定的MALDI-TOF数据库使得能够从临床标本中检测新的分类群，有助于了解它们在健康和疾病中的作用。在一个菌株的收集过程中，所有在培养组学研究中回收的菌株的沉积增加了在体外和体内实验中菌株的可用性，可使得它们作为益生菌使用。考虑到最近发现的新型抗菌药物由人类共同产生，这样的菌株收集可以促进寻找新的抗生素。

肠道菌群与疾病关系的探讨

由于细菌细胞是微生物的“单位”，纯培养是破译特定微生物和/或微生物在宿主健康中作用的关键一步。虽然宏基因组学对人类微生物群的研究产生了革命性的影响，但它仍然不容易区分同一物种之间的菌株，也不能为进一步的研究提供生物材料。因此，纯培养在描述微生物在健康和疾病中的相对作用方面仍然是不可或缺的一步。下面我们描述了两个最近的例子，理解肠道菌群落的变化与疾病有关的培养组学的贡献。

一些肠道微生物(新生儿梭菌、产气荚膜梭菌、丁酸梭菌和尿原性大肠杆菌)最近被报道与早产儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的相关。在一项病例对照研究中，培养组学帮助在病人中发现了产毒的丁酸杆菌，其中包括15名感染NEC的新生儿和15名对照组。有趣的是，只有对同一粪便样本进行的宏基因组学数据的回顾性分析才能发现这种细菌在病人中的过度表达，而常规分析则没有观察到任何变化。此外，毒素的分泌只能通过培养才能得到证实。细菌疗法(也就是恢复肠道菌群)可能是治疗这种严重疾病的一种很有希望的方法，因为这种疾病会影响10%的出生体重非常低的新生儿。

在另一个例子中，在年龄和地理因素之后，营养是肠道微生物组成和成熟的主要决定因素。严重的急性营养不良与全局肠道菌群不成熟有关，同时所有细菌的细菌负荷和细菌多样性也减少了。同一物种的不同菌株在营养不良后可能被耗尽或富集，当在实验模型中接种时，它们可能是有益的或有害的。最近的一个假设是，婴儿时期的营养不良可能导致有益的肠道微生物的不可逆转的流失。这一假说可以解释10%的治疗失败和尽管有治疗性饮食和抗生素的情行下仍然有4%的死亡率的原因。因此，进一步的治疗选择应包括补充缺乏的细菌(即特征良好的菌株)，以及治疗性饮食和有针对性的抗生素。对受恶性营养不良影响的尼日尔和塞内加尔的一批人进行了培养组学研究，并将他们与来自同一国家的对照者进行了比较。虽然宏基因组学有助于筛选克瓦希奥氏菌的潜在微生物特征，但与对照组相比，在受影响的个体中发现了45种缺乏细菌的培养物。其中12种被认为是潜在的细菌疗法。重要的是，这些菌株被储存起来，并可供进一步研究。

展望未来

除了上述培养组学的重启已经作出的贡献外，培养组学以及所有与培养相关的方法都将开辟新的研究领域，这些研究可能具有深远的应用价值。

微生物群落组成校正

肠道微生物组成的一些变化与疾病有关。培养组学可能在细菌疗法的发展中起着重要的作用，以治疗临床微生物群落的改变。

难辨棱状芽孢杆菌感染(CDI)是服用抗生素的老年人与保健相关的腹泻的主要原因。探讨CDI肠道菌群落变化的研究主要发现，肠道微生物多样性减少了，不同门和属的组成变化了。粪便微生物移植(FMT)可以恢复这种多样性。一些集中的治疗方法试图通过使用几种对CDI复发具有潜在保护作用的特定细菌来取代整套FMT。在第一项研究中，两个人接受了肠道细菌移植的治疗。随后的一项研究报告了55人接受混合细菌治疗，最近的一项研究测试了口服给药的SER-109，这是一种含有经乙醇处理的肠道细菌的胶囊。同时，在CDI中注射非毒性梭状芽孢杆菌的孢子似乎是一种很有前景的治疗方法。在此背景下，培养组学将有助于鉴定新的孢子化细菌，这些细菌可以有效地对抗CDI。最近另一个将培养组学应用于CDI研究的例子是在CDI中发现了难辨棱状芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的可能共存，尽管CDI被认为是对抗CD的候选。对肠道菌群组成的综合研究，包括培养组学研究，将能够以证据为基础选择所需的细菌来代替FMT。

纠正微生物组成也可能是治疗泌尿生殖道疾病的有效方法。膀胱癌在男性中诊断的频率比女性高。长期以来，这一差异被认为是由于男性吸烟者比例较高所致。然而，妇女吸烟率的增加并没有导致膀胱癌的显著增加。同时，尿液长期以来一直被认为是无菌的，但最近的研究表明，不是这样的。此外，泌尿微生物群落在男性和女性中似乎是不同的，放线菌和细菌种类在男性中所占的比例明显较高。值得注意的是，注射牛分枝杆菌作为治疗膀胱癌的一种方法，已被证明可以防止癌症复发。这一结果值得用宏基因组学和培养方法对尿液成分进行综合分析。

细菌性阴道病是一种正常阴道微生物的失调。其特点是向较高的细菌多样方向转移，正常的乳酸菌-优势微生物群落(如乳杆菌、金氏乳杆菌等)逐渐枯竭，阴道加德纳氏菌(Gardnerella)、阴道杆菌(A.inae)、厌氧菌属、嗜冷菌属(Peptonius)和普氏杆菌(Prevotella)等共同厌氧菌的过度生长。类似于FMT，阴道微生物移植可以通过恢复有益的阴道微生物群来解决粘膜微生物失调的问题。

治疗性免疫调节作用

共生微生物-尤其是来自肠道的微生物-对免疫的影响已经存在很长时间了。最近的研究揭示了肠道微生物在形成免疫过程中的作用。由于缺乏微生物群落，肿瘤坏死因子(TNF)的产生减少；因此，在一个实验模型中，这降低了免疫治疗的效率。用小鼠模型评价肠道菌群在抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA 4)抗体肿瘤免疫治疗中的作用，结果表明，缺乏特异性分类群(尤其是类杆菌和伯克氏杆菌)降低了治疗效果。口服菌种脆弱杆菌、B.taiotaomicron和头孢菌素(Burkholderia Cepacia)可恢复抗CTLA 4    抗体的抗肿瘤作用。从受治疗个体中回收细菌特异性T细胞显示，抗CTLA4抗体的功效部分依赖于先前接触细菌共生体。使用CTLA4阻滞剂治疗黑色素瘤的疗效取决于接受治疗的人肠道微生物组成。在动物模型中发现肠道菌群(特别是双歧杆菌属)参与黑色素瘤的发生。双歧杆菌属的施用增强了抗程序性细胞死亡配体1(PD-L1)癌症免疫疗法。此外，微生物群落也影响这些处理的毒性。结果表明，肠球菌和肠原虫Barnesiella增强型环磷酰胺(一种常见的烷基化免疫调节剂)对接受肺或卵巢癌治疗个体的疗效有显著增强效果。最近的研究表明，免疫调节治疗前的抗生素治疗明显降低了以PD-1为基础的对晚期上皮癌的免疫治疗效果。培养组学是这一研究领域中的一个重要应用，它可能会导致新的抗癌治疗方法的发展，这很可能依赖于微生物学的调节。

新型抗菌药物的发现

由于细菌是广泛用于治疗人类感染的几类抗菌药物的主要来源，使用培养组学使得细菌库的扩大可能会导致新的抗菌药物的发现。此外，细菌毒素(由细菌产生并能抑制密切相关物种生长的蛋白质或肽毒素)可由人类肠道菌群落的成员产生。然而，由于它们的活性范围很窄，它们的应用目前仅限于食品保存。随着人类微生物组研究发现许多编码抗菌药物的基因，人们对细菌毒素的兴趣增加了。有趣的是，阴道、呼吸道和口腔是肠道菌群落以外最多样的细菌资源库。人类微生物组作为新型抗菌药物的潜在来源得到了最近发现的的支持，鲁格列宁是一种由路邓葡萄球菌产生的能够抑制金黄色葡萄球菌定殖的短肽。此外，该肽对几种革兰氏阳性病原体具有活性，包括李斯特菌、肺炎球菌和肠球菌。最近的一项研究表明，几种梭状菌在体外和体内对单核细胞增生李斯特菌都有抑制作用。通过提供广泛的革兰氏阳性病原体，包括李斯特菌，肺炎球菌和肠球菌。最近的一项研究表明，几种梭状菌在体外和体内对单核细胞增生李斯特菌都有抑制作用。通过提供广泛的未鉴定的分类群和每个物种的多种菌株，培养组学培养的菌株有可能成为一种新型抗生素的来源。

结论

我们目前正在目睹一种范式转变，在这一范式转变中，对人类微生物群的操纵为治疗感染(如CDI)和治疗与微生物群变化有关的疾病(如癌症)带来了希望。这一方法的基础是益生菌的概念(如梅契尼科夫所界定的)，例如用于治疗腹泻的布拉酵母菌。然而，这一概念革命需要依靠对居住在人类肠道中的微生物群落的可靠认知。为此，需要大量努力通过培养发现新的分类群，以发现其余80%被认为不可培养的未知细菌。此外，这些细菌必须存储到数据库中，通常用于宏基因组研究。作为回报，测序研究可以促使对感兴趣的培养OTUs采取有针对性的培养方法，强调培养依赖研究和培养独立研究之间的互补性。这种强调将能够准确地识别特定疾病中缺乏的微生物。虽然FMT在CDI的治疗中有作用，最近在克罗恩病中也起了作用，在目前的配方中，它似乎没有任何其他的治疗潜力。对于“肿瘤学”(即提高免疫调节治疗癌症疗效的细菌疗法)，根据个人肠道菌群的病理和特征选择的有益细菌组合可能比标准配方更有效。总之，大规模生产，包括这些有益细菌的发酵步骤(通常很难培养)，再加上良好的医疗实践，可能是改变与微生物群落变化相关疾病细菌疗法的关键。

知识点

分类基因组学(Taxonogenomics)

分类基因组学是一种新概念，它使用科学界设定的遗传和表型标准以及最新的基因组和蛋白质组学数据来描述新的微生物物种。分类基因组学能够进一步探索微生物多样性，并澄清两个不同物种之间的界限。事实上，自最早的分类学研究以来，人们已经认识到，对一种新的微生物物种的描述需要一组标准化的形态学和生物化学特征来证明潜在新物种与那些物种之间的差异。在相同的属和相似性，证明其赋予该属的合理性。2000年代早期，PCR技术和16S核糖体RNA(rRNA)基因测序的发展影响了这一分类，表明两个菌株之间大的表型差异可能是由于不支持将它们分为两个不同的类型的可忽略的基因型差异造成的。目前，需要16S rRNA序列相似性的98.65％的阈值来评估两种细菌分离物是否属于不同物种。这一新标准导致了大量物种的重新分类。 然而，分类学研究表明，该阈值不适用于具有更高水平的 16S rRNA基因序列变异性的许多属。因此，16S rRNA基因测序分析并不是一个通用的工具，也不足以估计微生物的多样性。快速、低成本、完整的基因组测序技术(例如DNA-DNA杂交的替代方法)的发展将有助于开发新的、强有力的工具来分析和描述培养物发现新的微生物种类。

新物种发布(New species announcements)

培养组学是一种有效的策略以分离未知的微生物。当MALDI-TOF 对分离的细菌进行过三次测定都不能够进行准确鉴定时，对16S rRNA的基因进行测序。如果与最接近的官方菌株的相似性小于98.65%，那么该分离物可能是一个新种，采用培养策略鉴定的新物种的数量从每周1种到25种不等。事实上，已经发展出一种新的快速方法来发布一个新的物种，其中包括关于新物种的主要分类和表型特征的信息。因此，“新物种公告”是一种新的文章格式，它简要描述了分离菌株的样品的来源和主要生长条件。主要的形态特征包括菌落的大小和形态(如颜色和形状)，细胞的大小和革兰氏染色，过氧化氢酶和氧化酶活性的存在，新研究物种的分类在一个系统发育树上显示，该分类图显示了该物种在其门内的位置。还提到了16S rRNA 基因相似性分析的结果，该分析鉴定了具有有效公布名称的最密切相关的物种。最后，介绍了新物种名称的词源。新物种公告是一种快速发布新物种的有效方法，因为不可能对新物种进行测序，注释它们的基因组，并以与通过培养法发现它们的速度相同的速度发布它们的全部描述。所有完整的描述，包括基因组测序，都是比较晚执行的。

词汇表

微生物群(Microbiota)
生活在特定环境中的微生物种群。

共生生物(Commensal)
定殖的微生物不引起宿主的疾病。

益生菌(Probiotics)
有益于宿主健康的活微生物。

宏基因组学(Metagenomics)
直接从环境中分离的DNA的鸟枪法测序。

细菌疗法(Bacteriotherapy)
服用有活性的单个微生物或者含有微生物的整个生态系统，以改善人类健康的治疗方法。FMT是细菌疗法的一个例子。

微生物暗物质(Microbial dark matter)
宏基因组研究中未分配物种的序列。

基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI- TOF mass spectrometry)
将温和的电离方法(MALDI)与质谱联用，可以通过质量和电荷数鉴定蛋白质。

扩散室(Diffusion chamber)
一种允许微生物在其自然环境中生长的方法，将培养液夹在半透膜之间，允许与外部环境自由交换化学品。

专性厌氧菌(Obligate anaerobes)
无法在大气有氧存在的条件下生存的微生物。

套片小管(Shell-vial technique)
离心机增强组织培养试验

无菌培养基(Axenic media)
其中仅存在单一物种，品种或菌株，并且完全不含所有其他污染生物的培养基。

厌氧微生物(Anaerobes)
生长不需要氧气的生物。

谢德勒琼脂 (Schaedler agar)
推荐用于从临床标本中分离厌氧细菌的固体培养基。

木聚糖降解微生物群落 (Xylanolytic microbial communities)
群落中包含降解木质素的微生物。

分类基因组学(Taxonogenomics)
以基因组测序和表型信息结合的方法描述培养组学研究中分离的新分类群的现代方法。

操作分类单元(OTUs)
以DNA序列相似性为依据将未知生物DNA序列聚集成簇。

微生物组(Microbiome)
来自微生物群的所有基因和基因组。

夸休可尔症、恶性营养不良(Kwashiorkor)
临床营养性疾病，包括易怒、食物消化不良引起的腹泻、手足肿胀(营养水肿)、面部一般浮肿(圆脸)和皮肤变化(脱皮、黑色素沉积、黑斑和皮疹)。

粪便菌群移植(Faecal microbiota transplantation)
将粪便菌群从健康的个体转移到有疾病的个体。

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